Nanopore Sequencing, Dizileme Hizmeti, Sekans Hizmeti

Sequencing Services

Nanopore Dizileme Nedir?

Oxford Nanopore Technologies, nanopore tabanlı DNA ve RNA dizileme teknolojisini geliştirmiştir. Nanopore dizileyicinin genomik DNA, çoğaltılmış DNA, cDNA ve RNA gibi çeşitli girdi materyalleriyle uyumlu olduğu kanıtlanmıştır. Biyomolekülleri dizilemek için nanopore teknolojisi, patojenlerin tanımlanması, gıda güvenliği izleme, genomik analiz, metagenomik çevre izleme ve bakteriyel antibiyotik direncinin karakterizasyonu dahil olmak üzere yaşam bilimlerinde geniş uygulamalara sahiptir.

Nanopore Dizilemesi Nasıl Çalışır?

Nanopore dizileme, terimden de anlaşılacağı gibi, temelde bir moleküler adaptörün kovalent olarak bağlandığı bir nanopore'u kullanarak çalışır. Nanopore proteini dirençli bir filme sabitlendikten sonra, motor proteinler nükleik asitleri nanopore boyunca yönlendirmek için kullanılır. Nükleik asitler nanogözeneği geçerken, yük değişimleri meydana gelir ve dirençli filmdeki akımda değişikliklere neden olur. Nanogözeneğin oldukça küçük çapı göz önüne alındığında, yalnızca tek nükleik asit polimerlerinin geçişine izin verilir. Her nükleik asit bazı - adenin (A), timin (T), sitozin (C) ve guanin (G) - benzersiz yük özelliklerine sahip olduğundan, protein nanogözeneği boyunca kanalize edildiğinde akımda belirgin kesintilere neden olurlar. Bu akım sinyallerinin gerçek zamanlı izlenmesi ve yorumlanmasıyla, baz dizisi belirlenebilir ve böylece dizileme sağlanabilir. Altta yatan prensiplerin daha derinlemesine incelenmesi için "Nanopore Dizileme Prensibi" makalesine bakabilirsiniz.

Nanopore Dizilemenin Avantajları

Nanopore dizilemenin geleneksel dizileme iş akışlarına kıyasla bazı vurgulanmış avantajları vardır.

Yüksek moleküler ağırlıklı DNA (HMW-DNA) örnekleri için, birkaç yüz kb'lik ultra uzun okuma uzunlukları tek bir sürekli okumada dizilenebilir. Nanopore dizileme verileri, de novo genom montajlarını ve yapısal genomik varyant ve transkriptom çalışmalarını önemli ölçüde iyileştirmiştir.

Nanopore dizileme, 3. nesil DNA dizileme teknolojilerinden biridir ve diğer dizileme yöntemlerine göre birçok avantaja sahiptir. İşte nanopore dizilemenin başlıca avantajları:

1. Uzun Okuma Uzunlukları (Long Reads)

  • Nanopore teknolojisi, genomun büyük ve karmaşık bölgelerini daha kolay analiz etmeyi sağlar.

  • Uzun okuma uzunlukları sayesinde:

    • Yapısal varyasyonlar (inversiyon, translokasyon, büyük delesyonlar vb.) daha doğru bir şekilde tespit edilebilir.

    • Tekrarlı diziler gibi zor bölgeler daha iyi dizilenir.

    • De novo montaj için uygundur (referans genom olmadan genomun sıfırdan oluşturulması).

2. Hızlı ve Gerçek Zamanlı Sonuçlar

  • Nanopore dizileme, verileri dizileme işlemi sırasında gerçek zamanlı olarak üretebilir ve analiz edebilir.

  • Bu özellik, özellikle hızlı tanı gerektiren klinik uygulamalarda veya saha çalışmalarında büyük avantaj sağlar.

3. Taşınabilirlik

  • Nanopore cihazları (ör. Oxford Nanopore MinION) küçük, taşınabilir ve enerji tasarrufludur.

  • Bu sayede, laboratuvar dışı ortamlarda, saha araştırmalarında veya düşük altyapıya sahip bölgelerde kullanılabilir.

4. Modifikasyonları Okuyabilme (Epigenetik Analiz)

  • Nanopore teknolojisi, DNA veya RNA'daki modifikasyonları (örneğin, metilasyon) ek bir işlem yapmadan doğrudan tespit edebilir.

  • Bu, epigenetik çalışmalarda çok büyük bir avantaj sağlar.

5. Şablon Amplifikasyonu Gerektirmez

  • PCR amplifikasyonu gerektirmeden, DNA veya RNA'yı doğrudan okuyabilir.

  • Bu özellik, bias (yanlılık) oluşumunu önler ve uzunluk gibi fiziksel özelliklerin korunmasını sağlar.

6. Farklı Molekülleri Dizileyebilme Yeteneği

  • Nanopore teknolojisi sadece DNA değil, aynı zamanda RNA dizilemesi ve protein analizi için de kullanılabilir.

  • Bu, çok yönlü bir platform olarak farklı biyomolekülleri analiz edebilme imkânı sunar.

7. Maliyet Etkinliği ve Ölçeklenebilirlik

  • Kullanım amacına bağlı olarak düşük başlangıç maliyetleriyle (ör. MinION) küçük ölçekli projeler için idealdir.

  • Aynı platform daha büyük projeler için de ölçeklenebilir.

8. Hedefe Özgü ve Tüm Genom Analizi

  • Hedefe özgü bölgelerin dizilenmesinden tüm genom dizilemesine kadar geniş bir uygulama yelpazesi sunar.

9. Esnek Uygulama Alanları

  • Nanopore dizileme, klinik tanı, çevresel genomik, tarım biyoteknolojisi, adli tıp, evrimsel biyoloji ve daha birçok alanda uygulanabilir.

Bu avantajları sayesinde nanopore dizileme, hem araştırma hem de uygulamalı biyoteknoloji alanlarında güçlü bir araç olarak kullanılmaktadır.

Nanopore Dizilemenin Diğer Dizileme Tekniklerinden Farklı Olarak Öne Çıkan Ek Uygulama Alanları

Tüm Genom Birleştirmesinde Nanopore Dizilemesi

Tarihsel kısa segment genom birleştirme uygulamalarında, poliploidi, yüksek tekrarlama ve yüksek heterozigotluk ile karakterize edilen bazı hayvan ve bitki genomlarının karmaşıklıkları, başarılı genom birleştirmesi için son derece zorlu olduğu kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, doğal uzun okuma özelliği ile Nanopore dizileme teknolojisi, büyük genomların birleştirilmesini teşvik etmede avantajlıdır. Bu, birleştirilen genomun bütünlüğünü önemli ölçüde artırabilir.

Tam Uzunlukta Transkriptom İçin Nanopore Dizilemesi

Önceki transkriptom analizleri, genellikle mRNA'nın parçalanmasını ve ardından cDNA'ya ters transkripsiyonu gerektiren RNA'yı doğrudan dizileyemedi, böylece tam uzunluktaki transkripti yakalayıp analiz edemedi. Nanopore dizilemesinin uzun okuma özelliği, her genin birden fazla izoformunu doğru bir şekilde belirleyebilir ve hassasiyeti korurken süreci basitleştirebilir. Üstelik bu teknik doğrudan RNA dizilemesine izin vererek RNA baz değişikliklerini doğrudan belirler.

Büyük Yapısal Varyasyonları Saptamada Nanopore Dizileme

Genellikle insan hastalıklarıyla ilişkilendirilen çok sayıda büyük yapı varyasyonu (delesyonlar, inversiyonlar ve translokasyonlar vb.) genomda meydana gelir. Kısa okuma dizilemesi bu varyasyonları doğru bir şekilde saptayamaz. Ancak daha uzun okuma uzunluğuna sahip Nanopore dizilemesi, bu büyük yapısal varyasyonları saptamak için daha uygundur ve hastalık araştırmalarında ve ötesinde umut verici olasılıklar gösterir.

Mikrobiyomun Hızlı Tanımlanması İçin Nanopore Dizileme

Nanopore dizileme teknolojisinin hızlı ve gerçek zamanlı nitelikleri mikrobiyotanın tanımlanmasını hızlandırmıştır. Bu teknolojik yenilik, dizi bilgisi edinme sürecini kolaylaştıran saha tabanlı, toplama noktası dizilemesini mümkün kılar. Daha sonra, bu, artan verimlilik ve hızla çeşitli mikrobiyal türlerin tanımlanmasının yanı sıra taksonomik sınıflandırmaya da olanak tanır. Bu nedenle, Nanopore dizilemesi, mikrobiyal kimliklerin hızlı bir şekilde açıklanmasına önemli ölçüde katkıda bulunmuştur.

SSU (small subunit) – LSU (large subunit) Metagenomik Analizler

Metagenomik analiz ile bir numune içerisinde bulunan mikroorganizmaların çeşitliliğini ve miktarlarını belirlemek mümkündür. 16S rRNA tabanlı tür tanımlama, mikrobiyom çalışmalarında en yaygın olarak kullanılan yöntemdir. Bakterileri ~1500 bç uzunluğuna sahip 16S rRNA geni (V1 - V9) ile ayırt etmek artık standardize olmuş bir işlemdir. Ancak günümüzde kullanılan yeni nesil dizileme metotlarının çoğu bu genin sadece yaklaşık ~450 bç (V3 - V4) uzunluğundaki bir bölümü ile çalışmakta ve bu nedenle hatalı sonuçlar üretmektedir. 
Oxford Nanopore uzun okuma teknolojisi sayesinde 1500 bç uzunluğundaki 16S rRNA geninin tümünü; yani ~1500 bç (V1 - V9) okuyarak türlerin ayırımına yönelik çözünürlüğü arttırmış ve bu alanda yeni bir sayfa açmıştır. V3-V4 16S bölgesinin tür tanımlaması için yaygın kullanımı, nanopor dizilemesinin izin verdiği gibi, 16S rRNA geninin tam uzunluğunun kullanılması kadar hassas değildir. Oxford Nanopore Technologies tabanlı metagenomik analizler çok farklı örnek tiplerini veya bir örneğin bileşenlerini detaylı incelemek için oldukça fazla sayıda olanak sağlamaktadır. 
  • Uzun Okuma ile Daha Doğru Sonuçlar
  • Bakteri, Arkea, Mantar ve Ökaryot
  • 16S, ITS, 18S genleri
  • Karşılaştırmalı Analizler
Oxford Nanopore Dizileme Platformu üretilen uzun amplikonlar ile de analizler sunmaktadır.  16s rRNA bölgesinin V3-V4 bölgesini içeren yaklaşık 450 bç uzunluğunda hiper değişken bölge ile yapılan analizlerin yanısıra yaklaşık 1500 bç uzunluğunda ki tüm 16s rRNA bölgesinin çoğaltılmasıyla taksonomik çözünürlüğün arttırılması ve daha doğru sonuçlara ulaşılması mümkündür. İki yaklaşım arasındaki temel fark, kısa okuma için primer tasarımı ve amplikon üretimi için hiper değişken V3-V4 16S bölgesinin kullanılması (ortalama okuma uzunluğu - 450 bp), 16S rRNA geninin tam uzunluğu ise sadece Nanopore tabanlı mikrobiyom analizlerinde kullanılır (ortalama okuma uzunluğu – 1393 bp).  
Farklı canlı gruplarına yönelik barkod genleri kullanılarak bakteri ve arkea grupları 16s rRNA geni ile, mantarlar ITS bölgesi ile, ökaryotik canlılar 18S rRNA genine yönelik sekanslama ile metagenomik analizleri gerçekleştirilmektedir. İstenildiği taktirde çalışmanın içeriğine göre farklı veritabanları kullanılması, farklı iş akışları ile kombinasyonlar yapılarak sonuçların doğruluğunun arttırılması sağladığımız hizmetler arasındadır. Popülasyon ve biyomarker çalışmalarında, örnekler arası karşılaştırmalı analizler yapılır ve ilgili görsel grafikler çalışmanıza uygun olarak oluşturulur.